nplus1.ru/news/2019/12/24/granulosa-embryo

nplus1.ru/

Китайские эмбриологи научились добывать яйцеклетки из вспомогательных клеток яичника мыши. Они продемонстрировали, что такой метод безопасен для генома клеток и позволяет получить полностью жизнеспособное потомство. Едва ли он заменит яйцеклетки тем, у кого они по каким-то причинам не производятся, но теоретически может помочь людям с пониженной фертильностью — или тем, кто задумал себе «ребенка на заказ». Работа опубликована в журнале Cell Reports.

После того, как японские ученые Такахаши и Яманака придумали технологию репрограммирования соматических клеток в эмбриональные, появилась идея лечить таким образом бесплодие. Ведь если из любой клетки тела можно получить любую другую, то можно выращивать сперматозоиды и яйцеклетки для тех, у кого их по каким-то причинам недостаточно. Такие работы действительно появились, однако эффективность репрограммирования и выращивания половых клеток, как, впрочем, и любых других, все еще невелика.

Кроме того, классические методы репрограммирования предполагают генетическую модификацию клеток. В них необходимо внедрить «факторы Яманаки» — транскрипционные факторы, которые меняют экспрессию генов в клетках, и удобнее всего это делать с помощью вирусных векторов. Для всех других типов клеток этот метод подходит, но не для половых: вирусы могут внести какие-то изменения в геном, который может потом сказаться на здоровье потомства.

Поэтому группа исследователей под руководством Линь Лю (Lin Liu) из Нанькайского университета попробовала репрограммировать клетки мышей с помощью так называемых «малых молекул» — сигнальных небелковых веществ. Ученые предположили, что такой метод репрограммирования позволит получить безопасные с генетической точки зрения половые клетки.

В качестве источника материала для репрограммирования исследователи выбрали гранулезу — это клеточная оболочка, которая окружает яйцеклетку внутри фолликула и выходит вместе с ней в яйцевод во время овуляции. Ученые подобрали два вещества, Y27632 и кротоновую кислоту, которые позволили достаточно эффективно репрограммировать клетки гранулезы (на выходе получилось 27 клеточных линий против 7 — если репрограммировать методами, которые описывали другие авторы). Полученные химически индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (так из назвали авторы) обладали всеми свойствами эмбриональных клеток: дифференцировались в разные клеточные типы и образовывали опухоли из разных видов тканей (тератомы), если ввести их в организм мыши.

Затем ученые сформировали из полученных стволовых клеток яичники: для этого их смешали с клетками-предшественниками яичников из зародышей мыши и подсадили взрослым мышам под капсулу почки. Там сформировались полноценные яичники с яйцеклетками из репрограммированных клеток. Исследователи подтвердили, что в этих яйцеклетках запускается деление (мейоз), не возникает хромосомных аномалий, а теломеры становятся длиннее, чем в окружающих клетках (это необходимый процесс для формирования половых клеток, которым еще предстоит многократно делиться), а точечных мутаций — не больше, чем у стандартной культуры эмбриональных стволовых клеток (не более 10).

Наконец, чтобы проверить функциональность этих яйцеклеток, их извлекли из-под капсулы почки и in vitro оплодотворили сперматозоидами мыши. Эффективность оплодотворения была 40-50 процентов. Некоторые из полученных зародышей подсадили мышам, в результате родились пять полностью жизнеспособных мышат. Четверо из них дожили до взрослого возраста и принесли полноценное потомство.

Эффективность нового метода репрограммирования, как и у предыдущих, оказалась не очень высокой. Из полученных и подсаженных суррогатным матерям 171 эмбрионов прижились только пять. Тем не менее, во всех случаях ученым удалось подтвердить безопасность процедуры и генетическую целостность репрограммированных яйцеклеток.

Сами авторы работы отмечают, что едва ли этот метод поможет бороться с бесплодием — ведь для него нужны клетки гранулезы, которые удобнее всего получать при овуляции вместе с яйцеклеткой. Тем не менее, с его помощью можно было бы увеличить количество яйцеклеток, доступных для экстракорпорального оплодотворения, что помогло бы справиться с проблемой пониженной фертильности. Кроме того, чем больше яйцеклеток удается оплодотворить за раз, тем выше шансы выбрать здоровый или наиболее «удачный» эмбрион — недавно ученые подсчитали, что от количества доступных зародышей зависит, удастся ли выбрать наиболее высокого или умного ребенка.

Мы уже писали о том, как эмбриологи пытаются вырастить зародыши без участия яйцеклетки — например, недавно эмбрионоподобную конструкцию удалось получить из одной-единственной соматической клетки. Однако вне организма матери такие зародыши живут не очень долго — а человеческие эмбрионы и вовсе нельзя выращивать дольше двух недель.

Полина Лосева

nplus1.ru/news/2019/12/25/triple-edited-pigs

nplus1.ru/


Компания eGenesis, которая специализируется на производстве генетически модифицированных свиней для пересадки органов человеку, сообщила о рождении многократно отредактированных животных. Они потеряли три гена, приобрели девять, а также лишились 25 размножающихся в геноме вирусов. При этом свиньи совершенно здоровы и фертильны, а их клетки не вызывают агрессии у компонентов человеческой иммунной системы. Клинические испытания пересадок на людях планируются в ближайшие годы. Препринт работы выложен на портале bioRxiv.

На пути к трансплантации животных органов человеку стоят три препятствия. Первое — физиологическая совместимость: орган должен подходить по размеру, строению и функциям. В этом смысле удобным объектом является свинья, многие органы которой — например, сердце или почки — несущественно отличаются от человеческих.

Второе препятствие — иммунное отторжение. Организм человека реагирует настороженно на любые незнакомые молекулы, но некоторые — например, сахара на поверхности чужих клеток — вызывают особенно сильную агрессию.

Наконец, третье — это вирусы, которые носит в своем геноме каждый организм. Речь идет не об активных вирусах, которые вызывают эпидемии, а об эндогенных, то есть таких, которые не убивают клетку, а размножаются только в пределах ее ядра. Но если собственные вирусы клетка еще как-то держит под контролем, то если чужие клетки заразят ее новыми вирусами, то с последствиями их размножения она может не справиться.

Для того, чтобы орган свиньи стал совместим с человеком, с учетом всех этих требований, необходимо внести изменения сразу в ряд генов. Сначала этого пытались добиться посредством генных нокаутов, и сердце свиньи с несколькими нокаутами продержалось в организме павиана целых три года.

Но в 2015 году американский генетик Джордж Черч и китайский биолог Лухань Ян основали компанию eGenesis, целью которой стало создание свиней, модифицированных сразу по множеству генов. Через некоторое время ученые во главе с Черчем отчитались о том, что им удалось полностью очистить клетки свиней от эндогенных ретровирусов. Теперь же Черч и Ян сделали следующий шаг: создать одновременно «безвирусных» и иммунологически совместимых животных.

Для этого исследователям из eGenesis пришлось разработать многоступенчатый протокол. Для начала они взяли культуру фибробластов из уха обычной свиньи. С помощью электропорации в них ввели молекулы системы CRISPR/Cas9 чтобы вырезать из ДНК три гена, которые вызывают наиболее сильное отторжение в организме человека. Одновременно с тем в клетки ввели плазмиду с девятью новыми, уже человеческими генами, которые отвечают за подавление иммунного ответа и процессов свертывания крови. Таким образом, получившиеся клетки должны были не только не вызывать иммунную агрессию, но и подавлять ее.

Убедившись в том, что редактирование прошло успешно, ученые извлекли ядра фибробластов и поместили их в безъядерные яйцеклетки — это давно отработанный метод клонирования. Из яйцеклеток развились зародыши, которые подсадили суррогатным матерям, а те родили поросят первого поколения. Эти поросята еще несли в себе вирусы, но уже должны были получиться иммунологически совместимы с человеком.

Из их организма ученые снова выделили культуру фибробластов и провели в ней следующий этап редактирования: опять же, с помощью электропорации в клетки ввели систему CRISPR/Cas9, которая атаковала ген обратной транскриптазы — ключевого фермента, с помощью которого в геноме размножаются эндогенные вирусы. После этого ядра клеток так же выделили, поместили внутрь яйцеклеток и получили поросят второго поколения. Свиньи, таким образом, потеряли три гена, получили девять, и так же лишились двадцати пяти активно размножающихся вирусов.

Исследователи проверили, что отредактированные свиньи генетически стабильны. В их клетках действительно экспрессировались восемь из девяти человеческих генов и «молчали» гены, вызывающие иммунное отторжение. Ученые проверили геном животных на следы нецелевого (офф-таргет) редактирования и нашли несколько «промахов» CRISPR/Cas9, однако они не затронули белок-кодирующие участки ДНК.

Сами животные при этом были физиологически здоровы и фертильны. Несмотря на вмешательство в их иммунитет и систему свертывания крови, их анализы крови были в пределах нормы. Никакого влияния редактирования на работу сердца, печени и почек свиней ученые тоже не обнаружили.

Наконец, исследователи проверили, приобрели ли генетически отредактированные свиньи требуемые для трансплантации свойства. Сначала они выделили культуру клеток из стенок сосудов свиней и обработали ее человеческими иммуноглобулинами: они связывались с модифицированными клетками на 90 процентов меньше, чем с обычными. Затем на эти клетки подействовали человеческими белками комплемента — они реагируют на присутствие чужеродных клеток даже раньше, чем иммуноглобулины — но система комплемента активировалась не чаще, чем в случае с собственными, человеческими клетками.

Таким образом, ученым удалось создать животных, клетки которых не вызывают немедленной агрессии человеческого иммунитета. Несмотря на то, что иммунная система может среагировать на чужеродные клетки потом, распознав на них более редкие белки, с этим можно справиться с помощью иммуносупрессоров. Редактирование же позволяет избежать острого отторжения и выиграть время, за которое орган успеет прижиться внутри тела. В интервью Science Ян уточнила, что в 2020 году компания планирует сосредоточиться на доклинических испытаний, но рассчитывает перейти к исследованиям на людях в ближайшие пять лет.

В этом году мы уже несколько раз писали о новостях из мира трансплантации органов и тканей. Так, недавно человеку пересадили кожу свиньи — тоже генетически модифицированной, правда, только по одному гену. В Японии пациент впервые получил роговицу из репрограммированных стволовых клеток. А американские врачи отчитались о здоровье первого в мире мужчины, которому пересадили одновременно мошонку и пенис — говорят, у него все хорошо.

Полина Лосева