nplus1.ru/news/2020/02/25/crisprals


nplus1.ru/



Американским генетикам удалось замедлить развитие бокового амиотрофического склероза у мышей с помощью генной терапии. Ученые использовали метод редактирования оснований CRISPR/Cas9 для снижения экспрессии мутантной супероксиддисмутазы-1, в результате чего удалось увеличить продолжительность жизни больных животных и ослабить симптомы поражения мышц. Статья опубликована в журнале Molecular Therapy.

Боковой амиотрофический склероз (БАС) — это нейродегенеративное заболевание, которое поражает моторные нейроны и приводит к параличу и мышечной атрофии. Современные лекарства лишь несколько замедляют ее и облегчают симптомы — заболевание неизлечимо.

Большая доля случаев БАС (около 20 процентов) связана с мутацией гена супероксиддисмутазы-1 (клеточного антиоксиданта). Механизм участия этого белка в патогенезе изучен плохо, однако исследования показывают, что экспрессия его мутантных форм в моторных нейронах приводит к развитию БАС. В связи с этим один из возможных подходов к лечению БАС — полное выключение испорченного гена с помощью генной терапии. В результате неправильный белок не появляется в затронутых терапией клетках, что приводит к улучшению их функционирования.

Один из способов внесения изменений в геном — редактирование единичных оснований с помощью CRISPR/Cas-9. В этой технологии белок Cas-9 заменяет одну из букв ДНК на другую, в результате чего ген «ломается». Однако применение этого метода ограничено тем, что вирус, который используется для доставки CRISPR в клетки, не справляется с переноской таких больших частиц.

Авторы работы под руководством Колина Лима (Colin Lim) из Иллинойского Университета внедрили редактор оснований в человеческие клетки, разрезав его на две части, так что одна вирусная частица переносила только половину молекулы. Белок заменил одно основание в начале гена супероксиддисмутазы-1 и превратил его в стоп-кодон, последовательность, которая обозначает конец транскрипции. При экспрессии такого гена вместо целой РНК формируется только её короткий отрезок, который не кодирует функционирующий белок. В результате в клетках, в которые был введен редактор, образование супероксиддисмутазы-1 снизилось на 65 процентов.

Затем исследователи ввели полученный вирус под оболочку спинного мозга мышей — это популярный модельный организм для изучения БАС. Инъекция проводилась, когда животным было по 8 недель, за 6 недель до среднего возраста начала развития болезни. Далее каждую неделю мышей взвешивали и тестировали их моторные навыки. Терапия привела к снижению мышечной атрофии и улучшению работы нервно-мышечного аппарата (p < 0,05), а также к уменьшению потери веса на 43 процентов. В итоге продолжительность жизни животных после начала заболевания увеличилась на 39 процентов, а длительность поздней стадии БАС повысилась на 85 процентов.

Исследованный способ позволяет начинать терапию БАС уже после появления первых симптомов, тогда как многие другие разработки направлены на то, чтобы предотвратить или отсрочить начало болезни. Однако зачастую диагностировать БАС до его проявления не получается, поэтому необходима разработка методов лечения уже развившегося заболевания.

Недостаток редактирования оснований заключается в том, что кроме мутантного гена он может затрагивать и здоровые копии, поэтому ученые будут пытаться создать версию, которая будет направлена только на испорченные участки. Также работать необходимо над стратегией, которая позволит доставлять вещество по всему организму, а не точечно, как в опубликованной работе. В итоге, до применения метода в клинике еще далеко, однако это исследование может быть первым шагом в разработке новой терапии БАС


Подробнее про метод редактирования оснований можно прочитать здесь. А в этой статье описан способ лечения БАС другого типа. Здесь также работает система CRISPR/Cas9 — она разрезает микросателлитную РНК, накопление которой приводит к развитию заболевания.


Алиса Бахарева

nplus1.ru/news/2020/02/25/no-mitochondria-metazoa


nplus1.ru/

Израильские ученые обнаружили первое животное, митохондрии которого лишены ДНК. Этим животным оказалось маленькое беспозвоночное Henneguya salminicola из группы стрекающих. Его митохондрии потеряли способность производить собственные белки и дышать с помощью кислорода, поэтому и митохондриями в строгом смысле слова их назвать нельзя. Вместе с ними из ядерного генома исчезло большинство генов, отвечающих за эти процессы. Причиной потери митохондрий стала, вероятно, жизнь в бескислородной среде — Henneguya salminicola паразитирует внутри организма червей и рыб, где совершенно необязательно уметь полноценно дышать. Работа опубликована в журнале Proceedings of the National Academy of Sciences.

Одним из важных этапов в происхождении эукариот («ядерных» организмов) стало приобретение митохондрий. Судя по всему, когда-то они были бактериями, но потом поселились внутри будущих эукариотических клеток и постепенно утратили автономность. У современных эукариот митохондрии еще способны размножаться и дышать (то есть с помощью кислорода добывать энергию из органических молекул), но не могут полностью себя обеспечивать. Несмотря на то, что они сохранили остатки бактериальной ДНК, часть белков им приходится получать из цитоплазмы клетки, а соответствующие гены мигрировали в ядерный геном.

Долгое время считалось, что митохондрии свойственны абсолютно всем эукариотам. Однако в 2016 году чешские ученые описали первого эукариота, полностью лишенного митохондрий, — протиста Monocercomonoides, которого они выделили из кишечника шиншиллы. Кроме того, к тому времени уже было известно, что у многих одноклеточных эукариот, которые живут в бескислородной среде, митохондрии частично потеряли свои функции. При этом они изменились до неузнаваемости, превратившись в митохондриеподобные органеллы — мембранные пузырьки без ДНК, рибосом и крист (складок внутренней мембраны, которые необходимы для кислородного дыхания). Некоторые из них называют митосомами (они потеряли все функции, кроме нескольких ферментов), другие — гидрогеносомами (они научились получать энергию без кислорода, на выходе производя водород).

Тем не менее, до сих пор все эти превращения митохондрий были известны только для одноклеточных протистов. У многоклеточных животных неизменно обнаруживали полноценными митохондрии. Теперь же группа ученых из Университета Тель-Авива под руководством Доротеи Юшон (Dorothée Huchon) представила полные доказательства того, что животные, в том числе многоклеточные, тоже могут быть лишены митохондрий. Объектом их исследования стали миксозои — паразитические стрекающие. По сравнению со своими более известными родственниками — гидрами и медузами — миксозои пошли по пути радикального упрощения. В их организме осталось всего три типа клеток, а на некоторых стадиях развития они представляют собой одну большую многоядерную клетку, из-за чего их долгое время вообще не признавали многоклеточными.

В течение своего жизненного цикла миксозои поочередно паразитируют на рыбах и кольчатых червях, почти все время проводя в анаэробных условиях. Чтобы выяснить, что при этом происходит с их митохондриями, исследователи сравнили два близких пресноводных вида, которые паразитируют на лососевых рыбах — Henneguya salminicola и Myxobolus squamalis.

Отсеквенировав их геномы, ученые обнаружили у M. squamalis типичную кольцевую митохондриальную ДНК, но у H. salminicola ее найти не удалось. Это могло быть следствием неточной сборки отсеквенированного генома, поэтому исследователи подтвердили свои наблюдения с помощью микроскопии. Обработав клетки миксозой красителем DAPI, который избирательно связывается с ДНК, они заметили, что у H. salminicola окрашиваются только ядра, в отличие от M. squamalis, у которой можно заметить маленькие пятна митохондриальной ДНК. В то же время с помощью электронной микроскопии они подтвердили, что в клетках H. salminicola есть структуры, визуально похожие на митохондрии — двумембранные мешочки со складками внутренней мембраны.


Чтобы выяснить, какие функции еще способны выполнять митохондрии H. salminicola, ученые проверили, сколько генов, которые когда-то были митохондриальными, сохранилось в их ядерной ДНК. Оказалось, что среди генов, связанных с обменом веществ, уцелел 51 ген (и 57 у M. squamalis). Правда, из генов, связанных с дыханием, в ядерной ДНК H. salminicola остались всего 7 (у других миксозой их 18-25), причем «потерялись» именно те, которые кодировали белки для транспорта электронов и связывания кислорода. И среди 58 генов, которые отвечают за копирование митохондриальной ДНК у миксозой, у H. salminicola остались лишь 6 (у M. squamalis — 41). Это означает, что «упрощенные» митохондрии H. salminicola не полностью утратили свои функции: они способны, например, расщеплять углеводы, но не могут получать энергию с использованием кислорода, а также производить собственные митохондриальные белки.

Важной находкой для ученых стал ген, который кодирует одну из субъединиц полимеразы — белка, который должен копировать ДНК в митохондриях. В ядерном геноме H. salminicola этот ген превратился в псевдоген — в нем возникли три точечные мутации, которые мешают ему работать. Это означает, что предыдущие результаты — не артефакты секвенирования, и гены, необходимые для размножения митохондрий, когда-то действительно были в ядре H. salminicola.

Таким образом, в клетках H. salminicola находится митохондриеподобная органелла. У нее больше функций, чем у митосомы, и на гидрогеносому она тоже непохожа, но и полноценной митохондрией назвать ее нельзя из-за отсутствия генома и неспособности дышать с использованием кислорода. Судя по всему, митохондриальные гены пали жертвой упрощения: по сравнению с другими стрекающими, миксозои потеряли большинство органов и клеточных типов и, не останавливаясь на этом, начали избавляться от «лишних» генов в ядре и других органеллах. А способствовало этому окружение внутри их организмов-хозяев — внутри белых мышц рыбы кислорода совсем немного, и для того, чтобы там выжить, совсем необязательно уметь полноценно дышать.

Теперь мы знаем, что и среди многоклеточных животных встречаются организмы без настоящих митохондрий. Скорее всего, это не последнее открытие на этом пути: следующими могут стать некоторые анаэробные черви и морские лорициферы. У них подозревают наличие гидрогеносом — но пока только на основании микроскопии, генетическое подтверждение этих догадок еще только предстоит получить.

Недавно ученые обнаружили дышащие митохондрии в крови человека, отдельно от клеток. Также они выяснили, что внутри клеток эти органеллы могут разогреваться до 50 градусов по Цельсию, а удаление их помогает клеткам не стареть.

Полина Лосева

nplus1.ru/news/2020/03/10/london-cured

nplus1.ru/

Врачи не обнаружили следов ВИЧ в организме пациента в течение 30 месяцев после пересадки костного мозга. Это второй случай в истории, когда пересадка стволовых клеток смогла вылечить человека от ВИЧ. Решающим фактором, судя по всему, стало полное замещение собственных Т-лимфоцитов пациента на донорские. Отчет опубликован в журнале The Lancet.


До недавнего времени у человека, который встретился с вирусом иммунодефицита человека, было только две возможности — заразиться и всю жизнь принимать антиретровирусные препараты, чтобы сдержать инфекцию, или же не пустить его в свои клетки. Устойчивость определяется геном CCR5 — именно он кодирует белок на поверхности лимфоцитов, с которым связывается вирус, прежде чем проникнуть внутрь. Если в этом гене отсутствует небольшой участок (эту мутацию называют CCR5Δ32), то белок получается дефектным, вирус к нему не присоединяется, а человек не заражается.

В 2007 году выяснилось, что есть и третий путь — приобрести устойчивость вместе с чужими лимфоцитами. Пациенту по имени Тимоти Рэй Браун (которого знают как «берлинского пациента») пересадили кроветворные стволовые клетки от донора с мутацией CCR5Δ32, а через три года оказалось, что ВИЧ в организме Брауна больше нет. Тем не менее, повторять эту процедуру на других пациентах врачи не спешили: трансплантация красного костного мозга сопряжена со множеством рисков, и чаще всего для человека гораздо безопаснее продолжать стандартную терапию от ВИЧ.

В марте 2019 года врачи сообщили о том, что еще один пациент, вероятно, повторил судьбу Тимоти Брауна: его окрестили «лондонским пациентом». «Лондонский пациент» был ВИЧ-инфицирован уже почти десять лет, когда у него обнаружили лимфому Ходжкина на четвертой стадии. Врачам быстро удалось найти несколько подходящих ему доноров костного мозга — и один из них оказался носителем мутации CCR5Δ32. Спустя почти полтора года после трансплантации, когда от лимфомы пациента удалось вылечить, врачи обнаружили, что подавляющее большинство лимфоцитов в крови пациента — донорские, то есть устойчивые к инфекции. В рамках эксперимента пациент перестал принимать антиретровирусную терапию, и с тех пор медики пристально следят за его здоровьем.

К марту 2019 года лондонский пациент уже полтора года жил без лекарств от ВИЧ-инфекции, однако делать однозначные выводы никто не решался — слишком мало времени прошло после пересадки. Теперь прошел еще год: «лондонский пациент» рассказал газете The New York Times историю своего лечения, а его врачи — Равиндра Кумар Гупта (Ravindra Kumar Gupta) из Кембриджского университета вместе с коллегами — опубликовали свои наблюдения за его состоянием.

В течение 30 месяцев после трансплантации медики анализировали образцы крови, спермы, спинномозговой жидкости, а также биопсии лимфатических узлов и кишечника лондонского пациента. В биологических жидкостях вирусных геномов найти не удалось. Пределы чувствительности анализа не позволяют однозначно заключить, что ни единой вирусной частицы в организме пациента больше нет, однако, если они и остались, то в следовых количествах. Число Т-лимфоцитов, которое снижается в ходе ВИЧ-инфекции, выросло и приблизилось к значениям до трансплантации. В некоторых из них исследователи обнаружили остатки вирусных геномов — менее 2-3 на миллион клеток — но этот результат может оказаться ложноположительным.


По словам авторов статьи, исчезновение ВИЧ из организма могло стать следствием двух процессов: сокращение числа зараженных клеток (то есть Т-лимфоцитов самого пациента) или сокращение потенциального резервуара (то есть еще не зараженных Т-лимфоцитов). Чтобы предположить, какой именно процесс помог выздороветь пациенту, врачи воспользовались математической моделью, которая предсказывает шанс избавиться от ВИЧ в зависимости от длительности ремиссии (что отражает число зараженных клеток) и количества донорских клеток (сокращение резервуара).

Согласно анализу с помощью модели, если у человека все Т-лимфоциты неустойчивы (то есть могут быть заражены), но ремиссия длится 30 месяцев, шанс вылечиться составляет 38 процентов. У «лондонского пациента» врачи обнаружили 99-процентный химеризм, то есть почти все Т-лимфоциты, которые они нашли, были донорскими и устойчивыми. В такой ситуации модель предсказывает выздоровление с шансами почти в 100 процентов. Таким образом, сокращение резервуара для размножения вируса оказалось более значимым фактором, чем длительность ремиссии и число зараженных клеток.

На основании своих наблюдений лечащие врачи заключили, что теперь можно говорить о полном выздоровлении «лондонского пациента» от ВИЧ. Тем не менее, они обещают проверять его организм на наличие вируса два раза в год в течение последующих двух с половиной лет и раз в год — в течение еще пяти. В то же время, они отмечают, что переходить к широкому применению таких пересадок на людях еще рано. Наиболее удобным методом, по их мнению, могло бы быть редактирование генома собственных кроветворных клеток пациентов, однако безопасность этого метода еще не до конца изучена (как показало первое клиническое испытание, эффективность его тоже остается спорной).

В 2019 году ученые рассказали еще о нескольких пациентах, которые могли бы повторить успех «лондонского» и «берлинского», но об их судьбе пока ничего не известно. Зато известно, что пересадка костного мозга может в редких случаях привести к появлению донорских клеток в половых железах пациента.

Полина Лосева