Волновой геном №32. Беседы с Петровичем о главном
14 Авг 2015 22:30 #1693
Vladimirovich wrote:
Вот тут еще не очень плохо Michail Wolopasoff:
Неуместная вдруг летаргия
Завладела мозгами вчера
Приведите мне древнего Вия -
Сексуально взбодриться пора.
Vladimirovich wrote:
Провести мелом круг мимо жопы
Чтоб не смог промахнуться колдун...
Как чудны извращенья в Европе,
Как ужасен в Париже бодун.
Волновой геном №32. Беседы с Петровичем о главном
15 Авг 2015 05:32 #1695
Вика wrote:
Да что ж вам всем заговор мерещится. Причем тут Петрович? Я ведь написала причину своего интереса к статьям.
я проглядел
= там только критика
того что - есть
все остальное - бня типа
A theory, which predicts the probability of “two out of
three” misreading of different codons based on simple assumptions about the relative strength of the base pairs in
codon-anticodon interactions involving the first two codon
nucleotides, has already been presented (3). We must now
consider possible explanations for U* in the wobble position
reading U in the third codon position and for I seemingly
reading G. In the wobble hypothesis, Crick excludes the U-U
pair because the glycosyl bond separation distance is too
short. Topal and Fresco (12) have come to a similar c
Волновой геном №32. Беседы с Петровичем о главном
15 Авг 2015 08:08 #1696
Олег, спасибо, что прочли.
И критика тама этой "вобл-гипотезы", то бишь существуют ЕЩЕ "спаривания", не предусмотренные вобл-гипотезой. А как же таблица код.АМК?
Здец! Я как на Луне побывала. Так почему ж их обнаружили и куда они сейчас, эти неканонические и "супер"-неканоничестке "спаривания", делись?.
Волновой геном №32. Беседы с Петровичем о главном
22 Авг 2015 22:20 #1700
Хочешь что-то сделать хорошо -сделай сам.(на пост 1701)
Дорогие бояре, не пользы ради, а порядка для.
С целью ознакомления, выкладываю много текста на тему, о которой много лет говорим.
Проблема перекодировок находится не только "там", где "рибосома выбирает нужный из двух "омонимов"??".
По материалам защищенной докторской диссертации НО! в 1984 году(текст оригинальный).
К РР хочу обратиться с просьбой: если попадаются статьи современные, пожалуйста, выкладывайте, соответственно следующим разделам.
Предлагается для ознакомления старый (ли ????) материал:
Точность белкового синтеза
1. Уровень ошибок в реакции аминоацилирования
2. Точность рибосомного этапа белкового синтеза
3. Изучение неоднозначности
3.1 Переосмысление значащих кодонов
3.2 Распознавание нонсенс кодонов как смысловых
3.3 Ошибки фазы трансляции
Точность белкового синтеза
Ошибки при синтезе белка могут появляться в результате, по крайней мере, четырех стадий передачи генетической информации: синтеза мРНК, синтеза тРНК, реакции ферментативного аминоацилирования тРНК соответствующей аминокислотой и распознавания кодона на рибосоме. Две последние стадии относятся собственно к процессу белкового синтеза.
1. Уровень ошибок в реакции аминоацилирования
Поскольку точность рибосомного этапа трансляции определяется преимущественно кодон-антикодоновым взаимодействием, то очевидно, что ошибка аминоацилирования, т.е. присоединение к тРНК не специфичной для нее аминокислоты (мисацилирование) неизбежно повлечет за собой появление ошибочной аминокислоты в синтезирующейся белковой молекуле. Поэтому часто реакцию аминоацилирования тРНК соответствующей аминокислотой, катализируемую аминоацил-тРНК-синтетазами, называют ключевой реакцией белкового синтеза.
Появление ошибок в реакции аминоацилирования может произойти в результате распознавания ферментом чужеродной аминокислоты или чужеродной тРНК. Примером ошибочной реакции может служить активация валина, катализируемая изолейцил-тРНК -синтетазой из Е.coli (Baldwin and Berg, 1966).
Образование аминоацил-тРНК, катализируемое аминоацил- тРНК-синтетазами, для большинства (если не для всех) фер¬ментов разделяется на два этапа: активацию аглинокислоты (I) и перенос аминокислотного остатка на з’-конец тРНК (2):
Болдвин и Берг (Balawin, Berg, 1966) обнаружили ме¬ханизм корректирования ошибок распознавания аминокислот аминоацил-тРНК-синтетазами. Ими было установлено, что хотя изолейцил-тРНК-синтетаза из E.coli и катализирует актива¬цию валина, образующийся комплекс быстро расщепляется в присутствии изолейциновой тРНК; в результате образования стабильной валил-тРНКиле не происходит. Сходные данные бы¬ли получены и для валил-тРНК-синтетазы из Bacillus stearothe- rmophilus , которая способна активировать треонин с образованием связанного с ферментом треониладенилата
( Persht, Kaethner, 1976). Однако, в присутствии гомоло¬гичной тРНК такой комплекс расщепляется, и образования стабильной мисацилированной тРНК не происходит. Позднее бы¬ло установлено, что механизм корреляции в данном случае происходит за счет ферментативного деацилирования треонил- тРНКвал, т.е. после переноса треонинового остатка на валиновую тРНК ( Yarus, 1979).
Очевидно, что корректирование ошибочно активированной аминокислоты необходимо лишь для структурно близких аминокислот (валин-изолейцин или треонин-валин). Для структурно более далеких аналогов вероятность ошибочного распознавания столь низка, что она не может влиять на точность трансляции. Так, частота ошибочного распознавания а-аминомасляной кислоты цистеинил-тРНК-синтетазой из Е.coli рассчитана равной 2,9е-6 что примерно на два порядка ниже, чем частота ошибок белкового синтеза (Yarus, 1979).
Распознавание другого субстрата - тРНК аминоацил-тРНК- синтетазами потенциально может быть существенно более точ¬ным, т.к. в этом случае в акте распознавания могут участво¬вать значительные по длине последовательности нуклеотидов (тРНК) и аминокислот (фермент). Кроме того, в распознава¬нии определенную роль может играть и пространственная струк¬тура тРНК. Тем не менее, уже в ранних экспериментах была обнаружена способность к распознаванию аминоацил-тРНК-синтетазами чужеродных тРНК. Особенно высокий уровень ошибок наблюдался в гетерологичной системе in vitro , когда тРНК и фермент выделялись из разных организмов, например, дрожжей Е.соlі ( Dudock et al., 1971; Giege et al., 1971).
Реакция амноацилирования в таких системах протекает наиболее эффективно при высоком отношении концентраций Mg2+/АТР или в присутствии органических растворителей. В ряде случаев Kм для таких гетерологичных систем имеет низкое значение, приближаясь к Км для гомологичной системы, а значение Vmax, хотя и не достигает vmax. для гомологичной системы, но приближается к ней по значению ( Roe et а1, 1973). В гомологичной системе (тРНК и фермент из одного организма) при определенных условиях также может происходить распознавание аминоацил-тРНК-синтетазой чужеродной тРНК. Так, комплексы, содержащие неспецифическую тРНК, были получены для глютамил-тРНК-синтетазы из E.coli (Lapointe and Soil,1973) и других ферментов. Константы связывания неспецифических тРНК в ряде случаев приближались к значениям констант для образования корректных комплексов (Yarus, 1979). Кажущееся противоречие между высокой точностью реакции аминоацилирования и способностью к образованию таких неспецифических комплексов может объясняться следующим образом. Образование комплексов между аминоацил-тРНК-синтетазой и неспецифической тРНК in vitro обычно происходит в искусственных условиях, а именно, в отсутствии гомологичной тРНК, соответствующей ферменту по специфичности. Присутствие соответствующей тРНК резко снижает вероятность образования ошибочного комплекса, т.к.гомологичная тРНК конкурирует с чужеродной за участок связывания на молекуле фермента (Yarus 1972). Известно много примеров того, что ошибочное ацилирование обнаруживается в том случае, когда проводится инкубация очищенной аминоацил-тРНК-синтетазы с неспецифической тРНК в отсутствии специфической тРНК. В присутствии же смеси тРНК или же при проведении реакции в менее очищенной системе ошибочное ацилирование не регистрируется (Ebel 1973).
Фактором, повышающим точность реакции аминоацилирования, является стадия корректирования (proofreading ). Аминоацил-тРНК-синтетазы обладают гидролитической актив¬ностью как по отношению к корректно ацилированной, так и по отношению к ошибочно ацилированной тРНК (Еldred and Schimmel, 1972). Реакция протекает в соответствии с меха¬низмом:
Е + аминоацил-тРНК = Е + аминокислота + тРНК;
(Е - фермент аминоандл-тРНК-синтетаза)
Как видно из приведенной схемы, реакция протекает в отсутствии АМР и пирофосфата и не может рассматриваться как обратимая реакция аминоацилирования . Было высказано предположение, оказавшееся впоследствии справед¬ливым, что именно эта деацилирующая активность аминоацил- тРНК-синтетаз ответственна за исправление ошибок на уровне
активации аминокислоты, т.е. , что коррекция и "выбраковка" чужеродной аминокислоты происходит после ее переноса на з’-конец тРНК.
Поскольку изолейцил-тРНК (фен) и валил-тРНК (иле) подвергаются быстрому деацилированию ферментом, специфичным для тРНК, было предположено, что деацилирование, катализируемое аминоацил-тРНК-синтетазами, может играть важную роль в элиминации ошибочно ацилированных тРНК. Однако, наряду с этими данными в литературе имеются сведения о том, что ско¬рость решении деацилирования аминоацил-тРНК слишком низка ( Bonnet and Еbel , 1974), а ее специфичность недостаточна ( Bonnet et al., 1972), чтобы обеспечить повышение точнос¬ти образования аминоацил-тРНК.
Волновой геном №32. Беседы с Петровичем о главном
23 Авг 2015 17:55 #1701
2. Точность рибосомного этапа белкового синтеза
В ранних работах по изучению механизма белкового синтеза утвердилось мнение о том, что правильность расположения аминокислоты в синтезирующейся белковой молекуле определяется кодон-антикодоновым взаимодействием. В пользу такого вывода свидетельствовали многочисленные экспериментальные данные, подтверждающие адапторную гипотезу, результаты определения первичной структуры тРНК, эксперименты с использованием супрессорных тРНК с измененным антикодоном и т.д. Однако, в начале семидесятых годов стали накапли¬ваться сведения, которые, хотя и не опровергали такую точку зрения, однако, свидетельствовали о том, что она является упрощенной и не охватывает всей сложности проблемы.
К числу таких сведений относится наблюдение Горини ( Gorini, 1970) который установил, что мутанты E.coli с измененными рибосомами обладают повышенной или пониженной точностью трансляции, а также работа Хирша, доказавшего, что мутация по участку тРНК, локализованному вне антикодоновой области, изменяет кодоновую специфичность тРНК (Hirsh , 1971).
Начало работ Горини относится к 1961 году, когда ему удалось выделить класс мутантов E.coli , условно зависимых от стрептомицина ( CSD -мутанты) (Gorini et al., 1961; Gorini and Kataja,1964). Для одного из таких мутантов, являющихся ауксотрофами по аргинину, было установлено, что клетки приобретают способность к росту, если вместо этой аминокислоты в среде содержится стрептомицин. Кроме того, оказалось, что в экстрактах мутантных клеток в присутствии стрептомицина появляются некоторые ферменты, которые не обнаруживаются в отсутствии антибиотика. Горини предположил, что эффект стрептомицина, названный фенотипической супрессией, объясняется тем, что в его присутствии повышается уровень ошибок рибосомного этапа белкового синтеза.
Это предположение было подтверждено экспериментами по определению ошибок трансляции в бесклеточной системе (Davies et al., 1964).
Мутации в локусе str А, повышающие чувствительность клеток к стрептомицину, снижают как уровень ошибок трансляции, так и способность к фенотипической супрессии (Gorini 1974). В дальнейших исследованиях было установлено, что эти свойства обусловлены мутационным изменением белка s12 малой 30 S субчастицы рибосомы. Были обнаружены также мутанты по другому рибосомному белку малой субчастицы -s4, которые повышают уровень неоднозначности трансляции (Zimmerman et al., I971). Эти мутанты были названы ram (сокращение от ribosomal ambiguity ). Поскольку ram -мутации и присутствие стрептомицина обладают на клетки сходным эффектом, было сделало заключение о том, что антибиотик оказывает прямой эффект на рибосому.
Волновой геном №32. Беседы с Петровичем о главном
23 Авг 2015 18:00 #1702
продолжение п.2
Принципиальный вывод из работ Горини заключается в установлении им важной роли рибосомы в селекции тРНК в хо¬де трансляции. Эти работы Горини вместе с наблюдением Хирша (Hirsh, 1971), который установил, что триптофановая тРНК в результате мутации по D -стеблю изменяет свою кодо-новую специфичность и приобретает способность "осмыслять" нонсенс-кодон UGA, позволили предположить, что рибосома не просто влияет на кодон-антикодоновое взаимодействие, но обладает способностью к специфическому распознаванию участков тРНК, локализованных вне антикодона. В результате этих исследований возникло некое противоречие между двумя группами экспериментальных фактов. С одной стороны, в выборе аминоацпл-тРНК на рибосоме главную роль должны выполнять кодон-антикодоновые взаимодействия; вместе с тем рибосома каким-то образом модулирует селекцию тРНК, взаимодействуя с теми участками ее молекулы, которые не входят в состав антикодона, для разрешения этого кажу¬щегося противоречия Горини постулировал существование в рибосоме некого молекулярного "сита"
( ribosomal screen ); которое позволяет тРНК связываться с рибосомой, но может в определенных случаях препятствовать достижению тРНК того сайта, где осуществляется кодон-антикодоновое взаимодействие. Участие той или иной тРНК в процессе трансляции в этом случае может зависеть не только от ее антикодоновой специфичности, но также и от структурных особенностей иных участков молекулы, что создает дополнительный механизм дискриминации тРНК (Gorini , 1971). Следует сказать, однако, что молекулярный механизм такой селекции оставался неизвестным.
Позднее появилось несколько работ, в которых была сделана попытка конкретизировать и более детально охарактеризо¬вать процесс селекции и дискриминации тРНК в рибосоме. Заслуживает внимания кинетическая модель селекции тРНК, предложенная Нинио (Ninio,1974). Согласно этой модели, процесс селекции аминоацил-тРНК проходит в два этапа: на первом эта¬пе образуется непрочный комплекс между рибосомой и аминоацил- тРНК, а на втором - более прочная ассоциация и образование пептидной связи. Время перехода из первого состояния во второе является, согласно модели Нинио, переменной характеристикой, которая различается для рибосом мутантов разных классов, описанных Горини. Так, мутационные изменения рибосом, которые снижают время перехода, приводят к увеличению частоты ошибок трансляции, а изменения рибосом, увеличивающие это время, наоборот, уменьшают рибосомную неоднозначность. Другими словами, не нашедшее своего конкретного структурного воплощения "молекулярное сито" Горини было заменено тактически временным понятием - временем перехода.
В статье, что скинул РР (см.ссылку) есть много интересного, касательно кинет.мод.Нинио. rnajournal.cshlp.org/content/20/1/9.full.pdf+html
«This conclusion has been challenged recently (Demeshkina et al. 2012).
Волновой геном №32. Беседы с Петровичем о главном
23 Авг 2015 18:04 #1703
продолжение п.2
Наряду с кинетической теорией Нинио следует упомянуть гипотезу конформационной селекции, согласно которой молекула тРНК может находиться в нескольких конформационных состояниях, различающихся по способности к образованию специфического комплекса с кодоном ( Kurland et al., 1975; Kurland 1979). . Кодон-антикодоновое взаимодействие способно вызывать конформационное изменение молекулы тРНК в ее участках, отдаленных от антикодона. Возможно, (хотя этот факт нельзя считать доказанным), что такие структурные изменения тРНК, в свою очередь, могут влиять на кодоновую специфичность тРНК, связанной с рибосомой. Кинетическая теория и гипотеза конформационной селекции не исключают взаимно друг друга; кон- формационные изменения тРНК в ходе ее связывания с антикодоном, вероятно, играют определенную роль в процессе кинети¬ческой селекции.
Интересные данные были получены Томпсоном с сотрудника¬ми (Thompson and Stone ,1977;Thompson et al., I981), который выдвинул гипотезу о существовании этапа корректирования ошибок на рибосомном этапе белкового синтеза, который осуществляется с участием ЕF-Tu и GTP . Корректирование, согласно гипотезе Томпсона, осуществляется непосредственно после связывания аминоацил-тРНК с запрограммированной мРНК рибосомой до транспептидации и протекает с образованием про-межуточного комплекса аминоацил-тРНК- ЕF-ТU-GTP . Селекция комплекса рибосомой осуществляется за счет образования комплементарных пар оснований между кодоном мРНК и антикодоном тРНК. При связывании с антикодоном соответствующей амино- ацил-тРНК происходит гидролиз лишь одной молекулы GTP с последующим включением аминокислоты в синтезирующуюся поли- пептидную цепь. В том же случае, если с антикодоном связы¬вается несоответствующая ему аминоацил-тРНК, происходит стимуляция GТP -азной активности, и такая аминоацил-тРНК отвер¬гается, что сопровождается гидролизом дополнительной молекулы GIP . Следует, однако, сказать, что данные Томпсона были получены в системе in vitro , не содержащей одного из факторов элонгации - ЕF-G и запрограммированной неприродной матрицей - поли-U. Поэтому вопрос о существовании и роли такого этапа корректирования in vivo следует считать открытым. В целом следует подчеркнуть, что преобладающая часть данных по неоднозначности трансляции была получена в экспериментах in vitro . Скорость же элонгации в бесклеточных системах даже после тщательной оптимизации условий не превышает 0,05 пептидных связей в секунду в расчете на рибосому, в то время как соответствующее значение для условии in vivo достигает 10-20 ( Kurland , 1982). Вполне очевидно, что при различии в скорости процесса в 200-400 раз лимитирующие скорость этапы могут различаться in vivo и vitro. В последнее время разработаны бесклеточные системы поли-U -зависимого синтеза полифенилаланина, скорость образования пептидных связей в которых сопоставила с существующеи in vivo ( Kurland, 1982), однако, они еще не использовались для детальной характеристики механизма трансляции и, в частности, для определения уровня ошибок.
Интересные данные были по вкладу факторов элонгации в определении точности трансляций были получены при сравнении уровня ошибок в системе обычной и бесфакторной трансляций (Gavrilova et al., 1980). Было установлено, что рибосомы Е. col1 в присутствии матрицы поли- U обладают в 10-30 раз более высокой скоростью синтеза полифенилаланина по сравне-нию со скоростью полилейцина. Присутствие факторов элонгации существенно не влияет на уровень неоднозначности в такой бесклеточной системе при концентрациях Mg 2+ свыше 10mM. Добавление к бесфакторной системе фактора элонгации KF-Tu и или EF—G стимулирует скорость образования полифенилаланина и полилейщна в одинаковой степени. При низких же концентрациях Mg2+ (менее 10 мМ) в бесклеточной системе белкового синтеза, содержащей ЕF-Tu , синтез полилейцина происходит с существенно более низкой скоростью. Авторы, одна¬ко, не смогли сделать заключения о том, обусловлено ли та¬кое изменение в дискриминационной способности присутствием фактора элонгации ЕF-Tu или же только пониженной концентрацией Mg2+. Показательно, что предварительная обработка рибосом р-хлормеркурийбензоатом, которая стимулирует бесфакторную трансляцию на поли- U матрице (Gavrilova et а1, 1971) существенно повышает точность трансляции. Эти данные позволяют сделать вывод о том, что уровень неоднозначности трансляции определяется структурными компонентами самой рибосомы.
Волновой геном №32. Беседы с Петровичем о главном
24 Авг 2015 19:44 #1709
3. Изучение неоднозначности трансляции
Неоднозначность трансляции может реализоваться в виде следующих типов ошибок:
а) Переосмысление значащих кодонов, в результате которого происходит одиночная аминокислотная замена (кодон мРНК спаривается с антикодоном не соответствующей данному кодону аминокислоты). В принципе в результате переосмысления зна¬чащий кодон может считываться рибосомой и фактором терминации как бессмысленный, что приводит к появлению фрагмента полипептида.
б) Распознавание нонсенс-кодона как значащего (ошибки терминации). В результате таких ошибок происходит удлинение синтезирующегося полипептида и образование "сквозного" белка.
в) Ошибки фазы считывания мРНК, при которых считываются не триплеты, а дуплеты или квадриплеты основании.
Ошибки трансляции могут возникать как в результате естественного свойства аппарата белкового синтеза к неоднозначности "прочтения" информации, так и в результате мутационных изменений некоторых компонентов трансляции (тРНК, рибосомных белков и т.д.).
Естественный уровень неоднозначности не является минимально возможным, т.к. известны мутанты Е.соli устойчивые к аминогликозидным антибиотикам, для которых уровень неоднозначности трансляции ниже, чем у природных штаммов (Gorini, 1974). Этот факт может свидетельствовать о биологическом значении определенного уровня ошибок трансляции, видимо, в ходе эволюции был выработан оптимальный, но не наименьший уровень неоднозначности работы аппарата трансляции. Это заключение может быть справедливо как для переосмысления значащих кодонов, так и для распознавания нонсенс-кодонов как смысловых.
Волновой геном №32. Беседы с Петровичем о главном
24 Авг 2015 20:13 #1710
3.1 Переосмысление значащих кодонов
О значении для клеточной физиологии переосмысления значащих кодонов известно относительно мало. Очевидно, что повышение неоднозначности трансляции может иметь приспособительное значение при некоторых экстремальных условиях. Так, адаптивное изменение какого-либо взятого в отдельности белка или нескольких белков может быть достигнуто мутационным путем, однако, совершенно очевидно, что таким способом невозможно достигнуть изменения большого количества клеточных белков, что может быть необходимым при изменении условии среды. Этот результат может быть достигнут при повышении неоднозначности трансляции. Проведенные недавно эксперименты показали, что неоднозначность трансляции может иметь большее адаптивное значение, чем мутационный процесс для популяции гаплоидных организмов при периодических изменениях условий окружающей среды (Бачинский, 1981).
Ошибки трансляции (прежде всего, переосмысление значащих кодонов) могут выражаться в поливариантности белкового синтеза. В результате в клетке под контролем одного гена образуется группа, родственных белков, что расширяет возможности приспособления организма к меняющимся условиям среды. Существует предположение о том, что поливариантность может выполнять определенную роль и в процессах дифференцировки (Инге-Вечтомов и др., 1971).
С другой стороны, превышение некого уровня неоднозначности может иметь для клетки негативные последствия. В самом деле, при увеличении общей частоты ошибок трансляции число аминокислотных замен возрастает и в тех белках, которые входят в состав аппарата белкового синтеза, что, в свою очередь, может повлечь новое возрастание уровня неоднозначности. Бла-годаря такой положительной обратной связи в конечном счете клетка может потерять жизнеспособность. Оргел предположил, что такая "катастрофа ошибок" служит причиной старения фибробластов в культуре ( Orgel ,197О; Orgel , 1973). Следует признать, что экспериментальных данных, подтверждающих ги¬потезу Оргела, пока недостаточно. Правда имеется много данных о том, что синтез белка в "старых" клетках обладает повышенной термолабильностью и другими измененными свойствами, а синтезированные в таких клетках белки обладают высокой скоростью распада ( Goldstein and Singal , I974; linn et al., 1976; Shakespeare and Buchaman ,1976).
В последние годы, главным образом, благодаря развитию метода электрофореза в полиакриламидном в сочетании с электрофокусировкой, позволяющего разделять практически все белки клетки с высоким разрешением ( O*Farrel, 1975) стало возможным систематическое исследование ошибок белкового синтеза in vivo . О’Фаррел, а затем Паркер с сотрудниками нашли, что при голодании клеток бактерий (Е .coli ), а также культуры клеток яичников китайского хомячка и L-клеток мыши по некоторым аминокислотам происходит стимулирование ошибок трансляции. B результате в клетках накапливаются содержащие аминокислотные замены белки с измененным зарядом, которые легко идентифицируются на двумерной электрофореграмме. Направление смещения белка, содержащего аминокислотную замену, может быть предсказано, исходя из природы кодона и,в частности, из его третьего нуклеотида (табл. 3) (O*Farell 1975; Parker, 1978).
